Los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) proporcionan imágenes con una resolución extremadamente alta para el análisis de muestras. Lo complejo es capturar estas imágenes en la película sin perder el nivel de detalle. Los mismos elementos que hacen posible este nivel de detalle (los electrones) son responsables también de las dificultades inherentes a la micrografía electrónica.

Sin embargo, si se utilizan los electrones de forma eficaz, es posible optimizar la calidad de la imagen mediante el aumento de la densidad, la mejora del contraste y la reducción del ruido.

La clave está en utilizar más electrones, en otras palabras, en aumentar la tasa de muestreo.

• Mayor tiempo de exposición
• Reducción del aumento
• Ajuste de la exposición y del revelado
• Causas del ruido de las micrografías electrónicas

Mayor tiempo de exposición

El método más sencillo para emplear más electrones y mejorar la calidad de la imagen es incrementar el tiempo de exposición, tal y como se muestra en la figura 2. Las ventajas evidentes son el aumento de la densidad y del contraste. Además, también mejora la razón señal/ruido: la señal de la imagen aumenta linealmente con la exposición (número de electrones absorbidos), mientras que la estructura del ruido lo hace de forma más lenta con la raíz cuadrada de la exposición. Por otra parte, también es posible mejorar la densidad y el contraste con el aumento de la actividad de revelado (por ejemplo, ampliando el tiempo de revelado). Sin embargo, la señal y el ruido se incrementan proporcionalmente, lo que provoca una razón señal/ruido menos favorable que la que se logra con el aumento del tiempo de exposición.

Figura 2: si las condiciones de la muestra y del instrumento lo permiten, el hecho de aumentar la exposición incrementará la densidad de los negativos, intensificará el contraste de la imagen y mejorará la razón señal/ruido.

Reducción del aumento

Algunas muestras no toleran tiempos de exposición prolongados debido a su inestabilidad o a otros aspectos. En estos casos, reducir el aumento en el microscopio producirá una mejor calidad de la imagen. Si es necesario, se puede recuperar el aumento de forma fotográfica, con una lupa o con una ampliación fotográfica.

Figura 3: La reducción del aumento en el instrumento implica pequeñas pérdidas de detalles sutiles (3C en comparación con 3A). Los resultados son comparables a una micrografía registrada con un aumento total inferior (3B).

Si se reduce el aumento, pero se conserva el resto de condiciones, se permite que más electrones golpeen un área de la emulsión de la película sin que cambie el número de electrones que atraviesan la muestra. Tal y como aparece en la figura 3, la micrografía resultante es más densa y presenta un mayor contraste (3B en comparación con 3A). El aumento que se pierde se puede recuperar a través de un mayor aumento óptico (como se muestra en 3C). No obstante, esta recuperación en el tamaño de la imagen puede verse acompañada por un incremento de la granularidad de impresión a causa del aumento óptico más alto.

Se aprecia una mejor granularidad de impresión en la imagen donde hay un aumento inferior, en la cual se ha aumentado la tasa de muestreo (3B en comparación con 3A). No hay más información en 3C que en 3A, pero se ha logrado un mayor nivel de densidad y contraste sin aumentar la exposición; un factor importante en los casos en los que se exige una limitación de la exposición.

Ajuste de la exposición y del revelado

La estabilidad de la muestra determina en gran parte si la película puede recoger una cantidad mayor o relativamente menor de electrones. La película SO-163 para imágenes electrónicas funciona de forma eficaz en una gran variedad de exposiciones de electrones y responde a condiciones de revelado de compensación que producirán micrografías de una densidad de impresión similar. Debido a su versatilidad, la película SO-163 para imágenes electrónicas se puede utilizar con muestras estables e inestables.

Figura 4: Las características de rapidez y de señal-ruido de las películas para imágenes electrónicas se pueden ajustar a las condiciones de estabilidad de las muestras; para ello, hay que seleccionar la exposición de compensación y las condiciones de revelado. Estas condiciones funcionan como puntos de inicio.

En la figura 4, la corriente de haz es la más baja (menos electrones) en 4A, la intermedia en 4B y la más alta (más electrones) en 4C. En el mismo orden, el tiempo de revelado y la actividad del revelador se han reducido para compensar el aumento en el número de electrones recogidos. De hecho, la contribución de densidad por electrón que se necesita para producir una determinada densidad se modifica en el procesamiento para ajustar el número de electrones absorbidos. La finalidad aquí es, de nuevo, utilizar más electrones. Recoja tantos electrones como permita la estabilidad de la muestra y ajuste las condiciones de revelado para lograr la densidad y el contraste deseados.

Causas del ruido de las micrografías electrónicas

Los procesos utilizados en las micrografías electrónicas y en la fotografía normal son similares en muchos aspectos. Ambos implican la exposición de un material fotográfico, el procesamiento de este material para conseguir una imagen negativa y la impresión del negativo a una imagen positiva aumentada de tamaño. La principal diferencia es la radiación de la exposición: electrones para la micrografía electrónica y la luz para la fotografía convencional. Esta diferencia es un factor fundamental a la hora de trabajar con TEM y técnicas fotográficas, ya que los electrones interactúan con las emulsiones fotográficas de un modo totalmente diferente al de los fotones. Las fluctuaciones aleatorias de electrones en el haz son normales. Estas fluctuaciones dan como resultado un aspecto granular característico en el negativo fotográfico procesado. Esta estructura granular (ruido) se aprecia con mayor facilidad en las zonas de exposición de electrones uniforme (figura 5A) y no se debe al grano fotográfico inherente de la emulsión (figura 5B) ni es necesariamente una indicación de inestabilidad del instrumento.

Además, cada electrón incidente es capaz de interactuar con un cierto número de granos de haluro de plata a lo largo de su trayectoria irregular por la emulsión, lo que hace que se puedan revelar. Por lo tanto, los electrones intervienen de forma eficaz en la densidad de la imagen. Sin embargo, si se combina con las fluctuaciones características del haz, esta eficacia favorece la estructura granular, lo que se reconoce como ruido de la imagen.

Por otro lado, cuando la luz es la radiación de la exposición, varios fotones tienen que interactuar con cada grano de haluro de plata para que se puedan revelar. Esto se debe principalmente al nivel de energía de los fotones (de 2 a 3 voltios de electrones para la radiación visible), que es muy inferior al de los electrones de un TEM típico (de 50 000 a 100 000 voltios). Con la exposición de fotones, la transmitancia de una muestra se muestrea a una velocidad que es un orden de magnitud mayor que con la exposición de electrones. Como consecuencia, la granularidad con la exposición de fotones se reduce al nivel de la propia emulsión.