Os microscópios de transmissão de elétrons (TEMs) fornecem imagens com resolução extremamente alta para análise de amostras. O desafio é captar essas imagens no filme sem sacrificar esse nível de detalhe. Os próprios elementos que possibilitam esses detalhes (os elétrons) contribuem para as dificuldades inerentes da micrografia de elétrons.

Entretanto, ao usar os elétrons de forma adequada, é possível otimizar a qualidade de imagem maximizando a densidade, aumentando o contraste e reduzindo o ruído.

O segredo é usar mais elétrons: em outras palavras, aumentar a taxa de amostragem.

• Aumentar o tempo de exposição
• Reduzir a ampliação
• Ajustar a exposição e a revelação
• Causas de ruído em micrografias de elétrons

Aumentar o tempo de exposição

O jeito mais fácil de usar mais elétrons para aprimorar a qualidade de imagem é aumentar o tempo de exposição, conforme mostrado na Figura 2. Nesse caso, as vantagens óbvias são o aumento de densidade e contraste. Além disso, a proporção de sinal/ruído também melhora: o sinal da imagem aumenta linearmente com a exposição (número de elétrons absorvidos); já a estrutura de ruída aumenta menos rapidamente com a raiz quadrada de exposição. Obviamente, também é possível aumentar a densidade e o contraste aumentando a atividade de revelação (ex.: aumentando o tempo de revelação), mas o sinal e o ruído aumentam proporcionalmente, levando a uma proporção sinal/ruído menos favorável do que é obtido aumentando o tempo de exposição.

Figura 2: Caso as condições do instrumento e da amostra permitam, o aumento da exposição aumentará a densidade negativa, aprimorará o contraste da imagem e melhorará a proporção de sinal/ruído.

Reduzir a ampliação

Algumas amostras não conseguem tolerar longos tempos de exposição devido à sua instabilidade ou outras considerações. Nesses casos, uma redução na ampliação do instrumento produzirá uma qualidade de imagem melhor. Se necessário, a ampliação em seguida poderá ser reobtida fotograficamente, com uma lupa ou por meio de amplificação fotográfica.

Figura 3: Reduzir a ampliação do instrumento e compensar com pouca perda de detalhes finos (3C x 3A). Os resultados são comparáveis a uma micrografia registrada a uma ampliação total menor (3B).

Reduzir a ampliação e, ao mesmo tempo, deixar que todas as outras condições permaneçam iguais permite que mais elétrons atinjam uma área de unidade de emulsão no filme sem alterar o número de elétrons que passam através da amostra. Conforme mostrado na Figura 3, a micrografia resultante é mais densa e tem um contraste maior (3B x 3A). A ampliação sacrificada pode ser reobtida por meio de uma ampliação óptica correspondentemente maior (conforme mostrado em 3C). Entretanto, essa restauração do tamanho da imagem pode ser acompanhada por um aumento da granulosidade de impressão devido a uma ampliação óptica mais elevada.

Uma melhor granulosidade de impressão é óbvia a uma ampliação menor, em que a taxa de amostragem foi aumentada (3B x 3A). Não há mais informações em 3C do que em 3A, mas um maior contraste e densidade foram obtidos sem um aumento de exposição, fator importante em situações que demandam limitação de exposição.

Ajustar a exposição e a revelação

A estabilidade da amostra determina em grande parte se muitos ou relativamente poucos elétrons poderão ser coletados pelo filme. O Electron Image Film SO-163 funciona com eficácia ao longo de uma faixa de exposições de elétron e responde a condições de revelação compensadoras que vão gerar micrografias de densidade de impressão comparável. Por causa dessa versatilidade, o Electron Image Film SO-163 pode ser usado tanto para amostras estáveis quanto instáveis.

Figura 4: As características de velocidade e sinal/ruído do filme de imagem de elétrons podem ser ajustadas para acomodar as condições de estabilidade da amostra selecionando-se exposição compensatória e condições de revelação. Essas condições servem como pontos de partida.

Na Figura 4, a corrente de feixe é mais baixa (a menor quantidade de elétrons) em 4A, intermediária em 4B e mais alta (a maior quantidade de elétrons) em 4C. Na mesma ordem, o tempo de revelação e a atividade do revelador foram reduzidas para compensar o aumento do número de elétrons coletados. Na verdade, a contribuição da densidade por elétron que é necessário para produzir uma determinada densidade é modificada no processamento para acomodar o número de elétrons absorvidos. O objetivo aqui novamente é usar mais elétrons. Coletar o máximo de elétrons conforme a estabilidade da amostra permitirá que as condições de revelação sejam ajustadas e atinjam a densidade e o contraste desejados.

Causas de ruído em micrografias de elétrons

Os processos usados na micrografia de elétrons e na fotografia comum têm vários aspectos semelhantes. Ambos envolvem a exposição a um material fotográfico, o processamento desse material em uma imagem negativa e a impressão do negativo em uma impressão positiva ampliada. A principal diferença é a radiação-elétrons de exposição da micrografia de elétrons e a luz para fotografia convencional. Essa diferença é um fator fundamental ao se trabalhar com TEMs e técnicas fotográficas, porque os elétrons interagem com emulsões fotográficas de forma consideravelmente diferente do que os fótons. Flutuações aleatórias de elétrons no feixe são normais. Essas flutuações resultam em uma aparência granulosa características no negativo fotográfico processado. Essa estrutura granular (ruído) é mais prontamente observada em áreas de exposição uniforme a elétrons (Figura 5A) e não é devida ao grânulo fotográfico inerente da emulsão (Figura 5B) ou, necessariamente, uma indicação de instabilidade do instrumento.

Além disso, cada elétron incidente é capaz de interagir com vários cristais de haleto de prata ao longo de seu percurso irregular pela emulsão, fazendo que sejam reveláveis. Os elétrons, portanto, contribuem de forma eficaz para a densidade da imagem. Entretanto, em conjunto com as flutuações características no feixe, essa eficiência contribui com a estrutura granular, que nós reconhecemos como ruído na imagem.

Por outro lado, quando a luz é a radiação de exposição, vários fótons devem interagir com cada cristal de haleto de prata para torná-lo revelável. Isso é devido principalmente ao nível de energia dos fótons (2 a 3 volts de elétron para radiação visível), o que é muitas vezes inferior à dos elétrons em um TEM padrão (50.000 a 100.000 volts de elétron). Com a exposição a fótons, a transmissão de uma amostra é amostrada a uma velocidade que tem ordem de grandeza maior do que com a exposição a elétrons. Como consequência, a granularidade com exposição a fótons é reduzida ao nível da própria emulsão.