拍摄更好的电子显微照片

透射电子显微镜 (TEM) 为样本分析提供具有极高分辨率的影像。挑战在于,如何在不牺牲这种细节水平的情况下,在胶片上捕捉这些影像。使这种细节成为可能的元素 - 电子 - 造成了电子显微摄影中固有的困难。

然而,通过有效地利用电子,可以通过最大限度地提高密度、增强对比度和减少噪音来优化影像质量。

关键在于使用更多的电子:换言之,就是要提高采样率。

增加曝光时间

使用更多电子来提高影像质量的最简单方法是增加曝光时间,如图 2 所示。在这里,明显可见的好处是增加了密度和对比度。此外,信噪比也得到了改善:图像信号随曝光量(吸收的电子数)线性增加,而噪声结构增加速度慢于曝光量的平方根增加。当然,也可以通过增加显影活动(如增加显影时间)来提高密度和对比度,但信号和噪声会按比例增加,导致信噪比不如增加曝光时间来得有利。

图 2:在标本和仪器条件允许的情况下,增加曝光会增加负片密度,增强图像对比度,提高信噪比。

降低放大倍数

有些样本由于其不稳定性或其他考虑因素,不能容忍长时间的曝光。在这些情况下,降低仪器的放大倍数会产生更好的图像质量。如有需要,可以用放大镜或通过照片放大来重新获得放大倍数。

图 3:降低仪器放大倍数,并通过补偿达到几乎没有细节损失(3C 与 3A 相比)。结果与在较低的总放大倍数下记录的显微照片相当 (3B)。

降低放大倍数,同时让所有其他条件保持不变,可以让更多的电子撞击胶片上单位面积的乳剂,而不改变通过样本的电子数量。如图 3 所示,由此产生的显微照片密度更大,对比度更高(3B 与 3A 相比)。牺牲的放大倍数可以通过相应的更大光学放大倍数来重新获得(如 3C 所示)。然而,由于更高的光学放大倍数,这种图像尺寸的恢复可能伴随成像颗粒度增加。

在采样率提高的低放大倍数下,成像颗粒度的改善是明显的(3B 与 3A 相比)。3C 中信息并不比 3A 多,但在不增加曝光的情况下实现了更大的密度和对比度,这在需要限制曝光的情况下是一个重要因素。

调整曝光和显影

样本的稳定性在很大程度上决定了胶片是收集到很多还是相对较少的电子。电子影像胶片 SO-163 在一系列的电子曝光下都能有效地发挥作用,并对补偿性的显影条件做出反应,从而获得具有类似打印密度的显微照片。由于这种多功能性,电子影像胶片 SO-163 可以用来适应稳定和不稳定的样本。

图 4:电子影像胶片的速度和信噪比特性可以通过选择补偿性曝光和显影条件来调整,以适应样本的稳定性条件。这些条件可作为起点。

在图 4 中,电流束在 4A 中最低(最少的电子),在 4B 中居中,在 4C 中最高(最多的电子)。按照同样的顺序,显影时间和显影液活性都有所降低,以弥补收集到的电子数量的增加。实际上,在冲洗过程中,通过调整为产生特定密度所需的每个电子的密度贡献值,来适应吸收电子的数量。这里的目标也是为了使用更多的电子。在样本稳定性允许的情况下收集尽可能多的电子,并调整显影条件以达到所需的密度和对比度。

造成电子显微摄影噪音的原因

电子显微摄影和普通摄影的冲洗在许多方面都是相似的。两者都涉及到曝光照相材料,将此材料处理成负像,并将负像打印成放大的正像。主要的区别在于电子显微摄影的辐射电子曝光和传统摄影的光。在使用 TEM 和摄影技术时,这种区别是一个关键因素,因为电子与摄影乳剂的互动方式与光子的互动方式大不相同。电子在电子束中的随机波动是正常的。这些波动导致了在冲洗过的摄影底片中出现特有的颗粒状外观。这种颗粒状结构(噪音)在电子均匀曝光的区域最明显(图 5A),而不是由于乳剂固有的摄影颗粒(图 5B)所致,也未必是仪器不稳定的表现。

图 5:任何暴露在电子下的照相材料 (5A) 的颗粒结构都比同一材料暴露在光下 (5B) 时产生的结构要粗得多。

此外,每个入射电子能够沿着其在乳剂中的不规则路径与许多卤化银颗粒相互作用,使它们能够被显影。因此,电子有效地促进了影像密度。然而,结合光束中的特征波动,这种效率有助于形成颗粒状结构,我们将其视为图像中的噪音。

另一方面,当光作为曝光辐射时,一些光子必须与每个卤化银颗粒相互作用,以使其可被显影。这主要是由于光子的能量水平(可见光辐射为 2 到 3 个电子伏特),比典型的 TEM 中的电子(50000 到 100000 电子伏特)低很多倍。在光子曝光的情况下,样品的透射采样以比电子曝光大一个数量级的速率进行。因此,光子曝光的颗粒度被降低到乳剂本身的水平。